ПЦР реакцияләрендә интерференция факторлары

ПЦР реакциясе вакытында еш кына кайбер комачаулаучы факторлар очрый.
ПЦРның бик югары сизгерлеге аркасында, пычрану ПЦР нәтиҗәләренә тәэсир итүче иң мөһим факторларның берсе дип санала һәм ялган уңай нәтиҗәләргә китерергә мөмкин.
Ялган тискәре нәтиҗәләргә китерә торган төрле чыганаклар да шулай ук ​​мөһим. Әгәр ПЦР катнашмасының бер яки берничә мөһим өлеше яки көчәйтү реакциясе тоткарланса яки комачауланса, диагностик анализ тоткарланырга мөмкин. Бу нәтиҗәлелекнең кимүенә һәм хәтта ялган тискәре нәтиҗәләргә китерергә мөмкин.
Ингибирлаудан тыш, үрнәк әзерләү алдыннан җибәрү һәм/яки саклау шартлары аркасында максатчан нуклеин кислотасының бөтенлеге югалырга мөмкин. Аерым алганда, югары температура яки җитәрлек сакламау күзәнәкләргә һәм нуклеин кислоталарына зыян китерергә мөмкин. Күзәнәк һәм тукымаларны фиксацияләү һәм парафинны урнаштыру ДНК фрагментациясенең билгеле сәбәпләре һәм даими проблема булып тора (1 һәм 2 нче рәсемнәрне карагыз). Бу очракларда, хәтта оптималь изоляция һәм чистарту да ярдәм итмәячәк.

1 нче рәсем | Иммобилизациянең ДНК бөтенлегенә йогынтысы
Агароз гел электрофорезы күрсәткәнчә, мәетләрне аутопсиядән парафин кисемнәреннән аерып алынган ДНК сыйфаты шактый төрле булган. Фиксацияләү ысулына карап, экстрактларда төрле уртача фрагмент озынлыгындагы ДНК булган. ДНК бары тик туңдырылган үрнәкләрдә һәм буферланган нейтраль формалинде фиксацияләнгәндә генә сакланган. Көчле кислоталы Буэн фиксаторын яки буферланмаган, формалинны куллану ДНКның шактый югалуына китергән. Калган фракция югары дәрәҗәдә фрагментланган.
Сулда, фрагментларның озынлыгы килобаза парларында (кбп) күрсәтелә.

2 нче рәсем | Нуклеин кислотасы максатларының бөтенлеге югалуы
(а) Ике җептә дә 3′-5′ ара максатлы ДНКның өзелүенә китерәчәк. ДНК синтезы кечкенә фрагментта дәвам итәчәк. Ләкин, әгәр ДНК фрагментында праймерның яндыру урыны булмаса, сызыклы көчәйтү генә була. Иң уңай очракта, фрагментлар бер-берсен яңадан туендырырга мөмкин, ләкин нәтиҗә аз булачак һәм ачыклау дәрәҗәсеннән түбәнрәк булачак.
(b) Нигезләрнең югалуы, нигездә, депуринация һәм тимидин димеры формалашу аркасында, Н-бәйләнешләр саны кимүенә һәм Tm кимүенә китерә. Озын җылыну фазасында праймерлар матрица ДНКсыннан эреп китәчәк һәм хәтта җиңелрәк шартларда да җылынмаячак.
(c) Күрше тимин нигезләре TT димерын барлыкка китерә.
Молекуляр диагностикада еш очрый торган тагын бер киң таралган проблема - фенол-хлороформ экстракциясе белән чагыштырганда, максатлы нуклеин кислоталарының оптималь булмаган бүленеп чыгуы. Кискен очракларда бу ялган тискәре нәтиҗәләр белән бәйле булырга мөмкин. Кайнату лизисы яки күзәнәк калдыкларын ферментатив эшкәртү күп вакытны янга калдырырга мөмкин, ләкин бу ысул еш кына нуклеин кислотасының җитәрлек дәрәҗәдә бүленеп чыкмавы аркасында түбән ПЦР сизгерлегенә китерә.

Полимераза активлыгын көчәйтү вакытында ингибирлау

Гомумән алганда, ингибирлау оптималь булмаган ПЦР нәтиҗәләренә китерә торган барлык факторларны тасвирлау өчен контейнер төшенчәсе буларак кулланыла. Биохимик мәгънәдә, ингибирлау фермент активлыгы белән чикләнә, ягъни ул ДНК-полимеразаның актив үзәге яки аның кофакторы белән үзара бәйләнеш аша субстрат-продукт конверсиясен киметә яки булдырмый (мәсәлән, Taq ДНК-полимераза өчен Mg2+).
Үрнәктәге компонентлар яки реагентлар булган төрле буферлар һәм экстрактлар ферментны турыдан-туры ингибирларга яки аның кофакторларын (мәсәлән, ЭДТА) тотарга, шуның белән полимеразаны активлаштырмаска һәм үз чиратында ПЦР нәтиҗәләренең кимүенә яки ялган тискәрегә китерүенә китерергә мөмкин.
Шулай да, реакция компонентлары һәм максатлы нуклеин кислоталары арасындагы күп үзара бәйләнешләр "ПЦР ингибиторлары" дип тә билгеләнә. Күзәнәкнең бөтенлеге изоляция аркасында бозылгач һәм нуклеин кислотасы бүленеп чыккач, үрнәк һәм аны әйләндереп алган эремә һәм каты фаза арасында үзара бәйләнешләр барлыкка килергә мөмкин. Мәсәлән, "чуктыргычлар" ковалент булмаган үзара бәйләнешләр аша бер яки ике чылбырлы ДНКга бәйләнә һәм ахыр чиктә ПЦР реакция савытына барып җитә торган максатлар санын киметү юлы белән изоляциягә һәм чистартуга комачаулый ала.
Гомумән алганда, ПЦР ингибиторлары клиник диагностик тестлар өчен кулланыла торган күпчелек тән сыеклыкларында һәм реагентларда (сидектә мочевина, кандагы гемоглобин һәм гепарин), азык өстәмәләрендә (органик компонентлар, гликоген, май, Ca2+ ионнары) һәм әйләнә-тирә мохиттәге компонентларда (феноллар, авыр металлар) бар.

ПЦР ингибиторлары бактерияләрдә һәм эукариот күзәнәкләрендә, максатчан булмаган ДНКда, тукыма матрицаларының ДНК белән бәйләүче макромолекулаларында һәм перчаткалар һәм пластиклар кебек лаборатория җиһазларында күбрәк очрый. ПЦР ингибиторларын чыгару вакытында яки аннан соң нуклеин кислоталарын чистарту - өстенлекле ысул.
Бүгенге көндә төрле автоматлаштырылган экстракция җиһазлары күп кул протоколларын алыштыра ала, ләкин максатларны 100% торгызу һәм/яки чистартуга беркайчан да ирешелмәгән. Потенциаль ингибиторлар чистартылган нуклеин кислоталарында әле дә булырга мөмкин яки инде үз көченә кергән булырга мөмкин. Ингибиторларның йогынтысын киметү өчен төрле стратегияләр бар. Тиешле полимеразаны сайлау ингибитор активлыгына сизелерлек йогынты ясый ала. ПЦР ингибициясен киметүнең башка расланган ысуллары - полимераза концентрациясен арттыру яки BSA кебек өстәмәләр куллану.
ПЦР реакцияләрен тоткарлауны эчке процесс сыйфатын контрольдә тоту (ЭСК) ярдәмендә күрсәтергә мөмкин.
Нуклеин кислотасы изолятыннан этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол һәм фенол кебек барлык реагентларны һәм экстракция җыелмасындагы башка эремәләрне җентекләп юу адымы белән чыгарырга кирәк. Концентрациясенә карап, алар ПЦРны активлаштырырга яки тоткарларга мөмкин.