PCR реакцияләрендә комачаулык факторлары

PCR реакциясе вакытында кайбер комачаулый торган факторлар еш очрый.
PCR-ның бик сизгерлеге аркасында, пычрану PCR нәтиҗәләренә тәэсир итүче иң мөһим факторларның берсе булып санала һәм ялган уңай нәтиҗәләр китерә ала.
Ялган-тискәре нәтиҗәләргә китерүче төрле чыганаклар шул ук критик. PCR катнашмасының бер яки берничә мөһим өлеше яки көчәйтү реакциясе үзе комачауласа яки комачауласа, диагностик анализ комачаулый ала. Бу эффективлыкның кимүенә һәм хәтта ялган тискәре нәтиҗәләргә китерергә мөмкин.
Ингибиягә өстәп, максатлы нуклеин кислотасының бөтенлеген югалту үрнәк әзерләү алдыннан җибәрү һәм / яки саклау шартлары аркасында булырга мөмкин. Аерым алганда, югары температура яки саклауның җитәрлек булмавы күзәнәкләргә һәм нуклеин кислоталарына зыян китерергә мөмкин. Күзәнәк һәм тукымаларны фиксацияләү һәм парафин урнаштыру - ДНКның фрагментлашу сәбәпләре һәм дәвамлы проблема (карагыз рәсемнәр 1 һәм 2). Бу очракларда хәтта оптималь изоляция һәм чистарту ярдәм итмәячәк.

Рәсем 1 | Иммобилизациянең ДНК бөтенлегенә йогынтысы
Агароза гели электрофорезы күрсәткәнчә, автомобильләрнең парафин бүлекләреннән изоляцияләнгән ДНК сыйфаты төрлечә булган. Төрле уртача фрагмент озынлыктагы ДНК фиксация ысулына карап экстрактларда булган. ДНК туган туңдырылган үрнәкләрдә һәм буферланган нейтраль формалинда булганда гына сакланган. Көчле кислоталы Буин фиксатив яки тотрыксыз, формаль кислотасы булган формалин куллану ДНКның зур югалтуына китерде. Калган фракция бик зур фрагмент.
Сул якта фрагментларның озынлыгы килобаз парларында күрсәтелә (kbp)

Рәсем 2 | Нуклеин кислотасы максатларының бөтенлеген югалту
а) Ике юлдагы 3′-5 ′ аерма максатлы ДНКның өзелүенә китерәчәк. ДНК синтезы кечкенә фрагментта әле дә булачак. Ләкин, ДНК фрагментында примерны яндыру урыны җитмәсә, сызыклы көчәйтү генә була. Иң уңайлы очракта, фрагментлар бер-берсенә туенырга мөмкин, ләкин уңыш аз һәм ачыклау дәрәҗәсеннән түбән булачак.
б) нигезләрне югалту, нигездә, депуринация һәм тимидин димер формалашуы аркасында, H-облигацияләр санының кимүенә һәм ТМның кимүенә китерә. Озын җылыну этабында праймериз матрица ДНКдан эреп бетәчәк, хәтта катырак шартларда да анналь булмаячак.
в) күрше тимин нигезләре TT димерын тәшкил итә.
Молекуляр диагностикада еш очрый торган тагын бер киң таралган проблема - фенол-хлороформ чыгару белән чагыштырганда, максатлы нуклеин кислоталарының оптималь булмаган чыгарылышы. Экстремаль очракларда бу ялган тискәре карашлар белән бәйле булырга мөмкин. Күп вакыт кайнап торган лизис яки күзәнәк калдыкларының энзиматик ашкайнатуы белән сакланырга мөмкин, ләкин бу ысул еш кына нуклеин кислотасы аз булу сәбәпле PCR сизгерлегенә китерә.

Көчәйтү вакытында полимераз эшчәнлеген тыю

Гомумән, субоптималь PCR нәтиҗәләренә китергән барлык факторларны сурәтләү өчен контейнер концепциясе буларак кулланыла. Каты биохимик мәгънәдә, тыю ферментның активлыгы белән чикләнә, ягъни ДНК полимеразының актив сайты яки аның кофакторы белән үзара бәйләнештә субстрат-продукт конверсиясен киметә яки булдырмый (мәсәлән, Так ДНК полимерасы өчен Mg2 +).
Ampleрнәк компонентлары яки төрле буферлар һәм реагентлар булган экстрактлар ферментны турыдан-туры тыя яки аның кофакторларын каплый ала (мәсәлән, EDTA), шуның белән полимеразны инактивлаштыра һәм үз чиратында PCR нәтиҗәләренең кимүенә яки ялганына китерә.
Ләкин, реакция компонентлары һәм максатлы нуклеин кислоталары арасында үзара бәйләнеш шулай ук ​​'PCR ингибиторы' итеп билгеләнә. Күзәнәкнең бөтенлеге изоляция белән бозылгач һәм нуклеин кислотасы чыгарылганнан соң, үрнәк һәм аның тирәсендәге эремә һәм каты фаза арасында үзара бәйләнеш булырга мөмкин. Мисал өчен, "зиначылар" бер яки ике катлы ДНКны ковалент булмаган үзара бәйләнешләр аша бәйли ала һәм изоляциягә һәм чистартуга комачаулый, ахыр чиктә PCR реакция корабына барып җитә.
Гомумән, PCR ингибиторлары тәннең сыеклыкларында һәм клиник диагностик тестлар өчен кулланылган реагентларда (сидиктагы карбамид, кандагы гемоглобин һәм гепарин), диета өстәмәләре (органик компонентлар, гликоген, май, Ca2 + ионнары) һәм әйләнә-тирәдәге компонентлар (феноллар) бар. , авыр металллар)

PCR ингибиторлары киң таралган бактерияләрдә һәм эукариотик күзәнәкләрдә, максатсыз ДНКда, тукымалар матрицаларының ДНК бәйләүче макромолекулаларында һәм перчаткалар һәм пластмасса кебек лаборатория җиһазларында табылырга мөмкин. Нуклеин кислоталарын чыгару вакытында яки аннан соң чистарту - PCR ингибиторларын бетерү өчен өстенлекле ысул.
Бүгенге көндә төрле автоматлаштырылган чыгару җиһазлары күп кул протоколларын алыштыра ала, ләкин максатларны 100% торгызу һәм / яки чистарту беркайчан да ирешелмәгән. Потенциаль ингибиторлар чистартылган нуклеин кислоталарында булырга мөмкин яки инде көченә керергә мөмкин. Ингибиторларның тәэсирен киметү өчен төрле стратегияләр бар. Тиешле полимераз сайлау ингибитор эшчәнлегенә зур йогынты ясарга мөмкин. PCR тыюлыгын киметү өчен бүтән исбатланган ысуллар полимераз концентрациясен арттыру яки BSA кебек өстәмәләр куллану.
PCR реакцияләрен тыю эчке процессның сыйфатын контрольдә тоту (IPC) ярдәмендә күрсәтелергә мөмкин.
Барлык реагентларны һәм чыгару комплектындагы этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол һәм фенол кебек нуклеин кислотасын яхшылап юу адымы белән чыгару өчен сак булырга кирәк. Концентрациясенә карап, алар PCRны активлаштырырга яки тыярга мөмкин.